苹果酸在自然界广泛存在，是动植物新陈代谢的产物，是苹果中主要酸组分。将未成熟的苹果、葡萄、桃的果汁煮沸，加入石灰水，生成钙盐沉淀，然后将其转变为铅盐，再经处理生成游离酸，即可得到L-苹果酸。
发酵法也是可能实现工业化，使用变异了的酵母菌类进行发酵，可获得L-苹果酸为主的特殊菌类进行发酸，或使用以产生苹果酸为主的特殊菌类进行发酵，可获进L-苹果酸，但过程比合成法复杂，而且成本较高。
日本用生物合成法生产L-苹果酸。先将短杆菌氨基因细胞（breridacterium ammoni-agenes cell）用聚丙烯酸酰胺固定。细胞在生理盐水中悬浮液与丙烯酸酰胺和适当的交联剂以及聚合促进剂混合，所得凝胶制成3mm直径的颗粒。洗涤后，浸泡在含约0.3牛胆汁的反丁烯二酸钠中，溶液保持在37℃、20h。
经此处理的细胞即用作反应柱的填料。1L含1mol的反丁烯二酸钠在37℃通过反应柱，用通常的方法从流出物中分离苹果酸，从反丁烯二酸生产L-苹果酸药用级产品，收率约70%。