鉴别试验

  用0.4%氢氧化钠溶液配制0.001%的试样液，在紫外吸收光谱中的最大和最小吸收波长，应与由药典级叶酸配制的相同参比液相同。A256/A365的比值为2.80～3.00。

含量分析

 标准液的制备精确称取药典级标准叶酸30mg(干基计)，溶于每100ml含2ml氢氧化铵和1g高氯酸钠的水溶液中。按照测定步骤中所使用的注射量，使用相同的溶剂定量地调整体积，因而经色谱分析的是2～5μg的叶酸。

试样液的制备 按标准溶液的方法制备，使用经精确称重的试样，并按标准溶液的方法调整至相同体积。

流动相在1000ml容量瓶中放人35.1g高氯酸钠、1.40g磷酸二氢钾、7.0 mL1mol/L氢氧化钾和40ml甲醇，用水定容后，混匀。用1mol/L氢氧化钾调节pH值至7.2(为符合分析系统的要求，甲醇浓度可改变，以适于叶酸的流出时间)。

色谱分析系统常用的是在室温下操作的高压液相色谱仪，装有一(25～30)cm×4mm的不锈钢柱，其中充填直径为5～10μm的多孔硅或陶瓷微粒化学键合的十八烷基硅烷。流动相应保持一定的压力和流速，以取得要求的分辨率(见下述系统适用性试验)和适宜的流出时间。使用能在254nm处吸收紫外线的检测器。

系统适用性溶液用每100ml中含2ml氢氧化铵和1g高氯酸钠的水溶液作为溶剂，配制每ml各含1mg药典级参比标准叶酸和药典级甲酰四氢叶酸钙的溶液。使用前通过一孔隙度≤1μm，的膜滤器过滤溶液。

系统适用性试验用色谱仪分离相同体积(可达25μl)的标准液的5个进样，并按检测步骤测定峰响应值。按公式100×(标准偏差/平均峰响应值)计算峰响应值的相对标准偏差，不得超过2%。用相同方式注射25μ1体积的系统适用性溶液。按色谱仪通用试验用于R的公式计算甲酰四氢叶酸钙和叶酸之间的分辨率系数，不得小于3.6(用特殊的柱时，减少流动相中的甲醇量可提高分辨率)。

测定步骤用适当的进样阀或高压微型注射器，将相等体积(25#1以下)的试样液和标准液导入色谱仪，测定两溶液所得主峰的响应值。按下式计算试样中的叶酸(C19 H19N7O6)含量(mg)。

叶酸含量/mg=Vc×(Pu/Ps)
式中V——试样液体积，ml；
c——标准溶液中药典级标准叶酸的浓度，mg/ml；
Pu和Ps——分别为试样液和标准液的主峰响应值。