pH及离子强度对抗癌药物白藜芦醇与人血清白蛋白相互作用的影响

     白藜芦醇(Resveratrol，Res)，化学名为3，4’，5一三羟基二苯乙烯，是植物在遇到紫外线照射、真菌感染等不利条件下自然产生的抗毒素，目前至少已在21个科、31个属的72种植物中发现，其中在葡萄、虎杖和花生中含量较高[1]．白藜芦醇有很多生物学功能，如调节脂蛋白代谢，抑制低密度脂蛋白氧化l2一 ，抑制血小板聚集和减少前列腺素的产生l3]，清除过氧亚硝基阴离子引起的DNA损伤 ．Jang研究小组于1997年首先报道白藜芦醇具有较强的抗肿瘤活性，对肿瘤产生的3个阶段都有抑制作用l5]．此后许多研究证实白藜芦醇对皮肤癌、乳腺癌、肺癌、胃癌等多种肿瘤细胞有抑制作用[6]，目前世界上有1o余个国家和地区在开发白藜芦醇原料及制剂，白藜芦醇被喻为继紫杉醇之后的又一新的绿色抗癌药物，被人们广泛关注．

尽管白藜芦醇的药物活性得到了广泛的承认，但有关其在体内的运输及分布所知甚少．白藜芦醇的水溶性很低，在血液中必须与蛋白结合以保持较高浓度．本课题组报道了白藜芦醇通过与人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)和血红蛋白(Hemoglobin)结合完成体内运输l7 ．HSA是在人体血浆中含量最丰富的蛋白质，可广泛结合内源和外源性物质，如脂肪酸、代谢物、药物和金属离子，起着储存和运输的作用．药物和HSA的相互作用会影响药物在体内的运输和分布，对其相互作用的研究对于确定药物的作用机制、药物代谢动力学等方面具有积极意义．本课题组在研究白藜芦醇与HSA相互作用中，发现疏水作用是两者结合的主要作用力 ]．在两者的结合中，是否也存在静电作用还少见报道．本文中运用荧光光谱法测定不同pH及离子强度下，白藜芦醇与HSA的结合常数，应用分子对接方法计算了白藜芦醇在HSA上的具体结合位点，分析了静电作用在两者结合中的作用．该实验结果为研究白藜芦醇在体内的转动机制提供一定的依据．

1 实验部分

1．1 试剂与仪器白藜芦醇(99~／／0)和HSA(99％)均购自美国Sigma公司，其它化学试剂均为分析纯，实验用水为Milli—Q超纯水．Cary一100紫外一可见光谱仪(澳大利亚Varian公司)，F一4500荧光光谱仪(日本Hitachi公司)，pHS-29A酸度计．

1．2 溶液配置白藜芦醇溶于50 DMSO中作为母液，4℃ 暗处保存，临用前用PBS(pH 7．4)稀释至 2．0×10 mol L 备用；HSA在使用前用缓冲液配成2．0X 10 mol L 溶液备用，其摩尔浓度由分子量66 500 Da计算得到．

1．3 荧光测定白藜芦醇对HSA的荧光猝灭以280 nm作为激发波长，狭缝宽度为5 nm／5 nm，扫描速率为240 nm min ，记录290 nm至410 nm荧光光谱．测定过程如下：准确移取3 mL浓度为2．0×10 tool L 的HSA溶液于1 cm石英比色皿中，用微量注射器逐次加入2．0×10 mol I 的白藜芦醇溶液进行荧光滴定，总滴定量不超过蛋白体积的3．5 ．蛋白与药物充分混合保持10 min后测量．

1．4 pH对HSA-白藜芦醇相互作用影响 用0．15 mol I NaC1水溶液分别配制0．2 mol L pH 5．0 HAc-NaAc缓冲液，0．2 tool L～ pH 6．0、pH 7．0 Na2HP04一NaH2PO4缓冲液，0．2 mol L— pH 8．0 Tris-HCl缓冲液．维持体系pH值和离子强度不变，分别用上述缓冲液配制HSA贮液．按上述测定荧光光谱方法，测定不同pH下的HSA与白藜芦醇相互作用荧光光谱．

1．5 离子强度对ItSA-白藜芦醇相互作用影响在PBS中分别加入不同浓度的KCl(O、0．05、0．1、0．2 mol I )，按上述测定荧光光谱方法，测定不同离子强度下HSA与白藜芦醇相互作用荧光光谱．

1．6 分子对接采用AutoDock 3．05程序包计算【9]．HSA和白藜芦醇的晶体结构来自蛋白数据库(HSA 编码：lh9z，白藜芦醇编码：ldvs)．化合物的几何结构采用AutoDockTools软件优化l_1 ．相互作用采用 Lamarckian遗传算法，配体采用柔性处理方式，分子对接起始位置、方向随机，每个计算包括100个循环．遵循能量及几何匹配原则来选择最优结果．

2 结果与讨论

2．1 白藜芦醇对IISA的荧光猝灭在生理pH(7．4)下，不同浓度的白藜芦醇与HSA作用后蛋白的荧光光谱变化见图1．由图可知，在激发波长为280 nm条件下，HSA在337 nm处有最大发射峰．白藜芦醇的加入导致 HSA的内源荧光发生猝灭，存在浓度依赖关系，但最大发射峰的位置不变，说明白藜芦醇与HSA之间存在相互作用．

2．2 pH对HSA-白藜芦醇荧光光谱的影响在280 nm激发波长下，HSA-白藜芦醇在不同pH 缓冲液中的荧光光谱见图2．由图知，不同pH值没有引起HSA-白藜芦醇的荧光最大发射峰发生移动，但荧光强度发生变化，且随pH增大，荧光强度增强．

2．3 不同pH下HSA-白藜芦醇结合参数荧光猝灭数据可由Stern-Volmer方程进行分析 ：下 F0 一I+KsVEQ] (1)

FO和F分别是无猝灭剂和存在不同浓度猝灭剂时荧光物质的荧光强度，Ksv是Stern-Volmer猝灭常数，[Q]是猝灭剂的浓度．将Fo／F对白藜芦醇浓度作图(见图3)，得到不同pH值下的Stern-Volmer猝灭常数．

由表中数据可知，不同pH值下白藜芦醇对HSA的猝灭速率常数在10¨L tool。S。数量级．各种猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭速率常数为2×10 I tool。S_u“]，显然表中的猝灭速率常数远大于动态猝灭速率常数，说明不同pH值下白藜芦醇对HSA的猝灭都是形成了复合物的静态猝灭．同时还可看出，随着pH的增加K 、，，K。和K都呈现增加的趋势，即偏高pH值促进了白藜芦醇与HSA的结合．白藜芦醇为多酚类物质，在偏酸性条件下较稳定，随着pH增加，离子化程度增加，由此可推测，在白藜芦醇和HSA的相互作用中静电作用力起到了一定作用．

2．4 离子强度对白藜芦醇-HSA结合的影响在PBS中加入不同浓度的KCI，以研究离子强度对HSA与 白藜芦醇结合的影响，结果见表3．当离子强度不断增加时，HSA的最大发射峰位置未发生变化(图未显示)，表明离子强度不改变HSA-白藜芦醇复合物的结构．由表可知复合物的结合常数随离子强度的不断增大而减小，表明离子强度影响HSA与白藜芦醇间的亲合力，离子强度越大，亲合力越小．静电作用在HSA与 白藜芦醇的结合中起到了一定作用，这与pH影响研究结果相一致．

2．5 白藜芦醇与HSA 相互作用的分子对接 白藜芦醇与 HSA分子对接的最优能量结果见图4．由图可知，

白藜芦醇位于HSA 上亚结构域工B和ⅡA 之间的疏水腔内，位点工的人口处．在距离白藜芦醇 4×10。。1Tt范围内，3个带正电荷的氨基酸，Lysl06、Lys199和 His242，可与白藜芦醇形成静电作用，因而静电作用在 白藜芦醇与HSA的结合中发挥作用．这与前面pH及离子强度影响研究结果相一致．

3 结论

抗癌药物白藜芦醇由于其低的水溶性，在体内的运输过程中必须与蛋白结合以保持其较高浓度．HSA 是人体外源及内源物质运输的主要载体．本研究小组前期研究发现疏水作用是白藜芦醇与HSA之间结合的主要作用力 ．本研究表明pH及离子强度均影响白藜芦醇与HSA之间的相互作用，较高的pH及较低的离子强度有利于两者结合．pH及离子强度实验结果和分子对接结果均表明静电作用在两者结合中起到一定作用．本研究结果为了解白藜芦醇在体内的转动机制提供了一定的基础．