高效液相色谱法测定联苯甲酸异构体的含量
刘博谦1 , 　杨秋青2 , 　侯士聪1
(1 .中国农业大学理学院, 北京　100193 ;2 .河北师范大学实验中心, 河北石家庄　050016)

摘要:建立了3 位和4 位联苯甲酸同分异构体混合物的高效液相色谱法(HPLC)含量测定.色谱柱为SymmetryC18 , 检测波长254 nm, 流动相为甲醇-磷酸二氢钾(1.2 mol/ L), 流速1 mL/min.3-联苯甲酸的线性范围是48～ 720 mg/ L, 4-联苯甲酸线性范围是21～ 685 mg/ L;最低检出质量浓度均为0.01 mg/ L , 相关系数分别为0.999 2和0.999 8 ;平均回收率分别是99 .4 %和98 .8 %(n =6), RSD 分别为0.87 %和0 .93 %.

关键词:联苯甲酸异构体;HPLC ;含量测定
中图分类号:O 657 .7 +2 　　　文献标识码:A 　　　文章编号:1000-5854(2009)06-0770-03

3-联苯甲酸和4-联苯甲酸是同分异构体, 在采用甲苯氧化生成苯甲酸的合成工艺中, 同时生成3 位和4位联苯甲酸异构体副产物;其母体结构联苯是由2 个独立苯环构成的多环芳香烃, 是一种重要的有机原料,由于其衍生物独特的结构而显示出特殊的作用, 近年来在医药、染料、液晶[ 1～ 3] 等领域的应用不断深入, 显示了良好的应用前景.我国目前对联苯和联苯衍生物的需求量不断增大.

3-联苯甲酸和4-联苯甲酸还是合成糖尿病等药物原料的中间体, 由于两者分子量相同, 结构相近, 性质相似, 具有相近的紫外吸收, 故两者的分离和含量测定较为困难.3 位和4 位联苯甲酸同分异构体的高效液相色谱法(HPLC)测定未见报道.

1 　仪器与试剂
1 .1 　仪　器
Waters 1525 高效液相色谱仪(美国Waters 公司), 2487 双通道紫外检测器, 自动进样系统.
1 .2 　试　剂
甲醇为色谱纯(美国迪马公司), 磷酸二氢钾和磷酸均为分析纯, 水为高纯水.
1 .3 　高效液相色谱条件
色谱柱:Symmet ry C18 5 μm , 4 .6mm ×150 mm ;流动相:甲醇+磷酸二氢钾缓冲溶液;流速1 mL/min ;进
样量10 μL ;检测波长254 nm .
2 　方法与结果
2 .1 　优化色谱条件
由于3 位和4 位联苯甲酸同分异构体的结构相近, 性质相似, 它们的紫外吸收峰接近, 两色谱峰的保留时间相差不大, 难以分离.本实验着眼于色谱条件的优化, 筛选出流动相中甲醇和磷酸二氢钾缓冲溶液的最佳配比, 确定测试温度和溶液pH 值, 以达到两峰基线分离的目的.pH 值分别选择2 , 3 , 4 , 4 .5 时, pH 值的变化对本实验影响显示:pH 为2 , 3 时好于pH 为4 , 4 .5 ;故选择pH 在2 ～ 3 .选择温度20 , 30 , 40 , 50 ℃变化不等, 均未发现分离效果的转变, 故本实验采用室温测试.

经过流动相不同比例变化的多次实验结果显示, 随着甲醇质量浓度由高到低的变化, 两峰的分离度逐渐变大, 两者的保留时间增大, 两峰的分离度也随之加大(见图1a , b);当V (甲醇)∶V(水)(磷酸二氢钾1 .2mol/L)=65∶35 时两峰实现基线分离, 此时3-联苯甲酸的保留时间为9 .70 min , 4-联苯甲酸为10 .68 min。

2 .2 　检出限和线性关系的考察
分别精密吸取3-联苯甲酸和4-联苯甲酸对照品溶液5 , 10 , 15 , 20 , 30 μL , 进样, 依照上述优化色谱条件测试峰面积, 以峰面积Y 为纵坐标, 进样量X (μg)为横坐标进行线性回归, 分别得两者的回归方程为
3-联苯甲酸:Y =4 .64 ×10³X -6 .92 ×10³ ,
R =0 .9992 .
4-联苯甲酸:Y =4 .23 ×10⁶X -4 .63 ×10⁴ ,
R =0 .9998 .

结果显示:3-联苯甲酸最低检出限为0 .01 mg/L ,进样量在48 ～ 720 μg 与峰面积呈良好线性关系;4-联苯甲酸最低检出限为0 .01 mg/L , 进样量在21 ～ 685 μg线性良好.

2 .3 　精密度试验
分别精密吸取3-联苯甲酸和4-联苯甲酸对照品溶液10 μL , 连续进样6 次, 依照上述优化色谱条件测定峰面积.3-联苯甲酸峰面积的RSD 为0 .39 %, 4-联苯甲酸峰面积的RSD 为0 .54 %.

2 .4 　重复性试验
精密称取同一批号样品5 份, 制成供测试样品溶液, 在上述优化色谱条件下测定3-联苯甲酸和4-联苯甲酸混合试样, 计算平均含量分别为0 .056 , 0 .042 g/L , RSD 分别为0 .59 %和0 .81 %.

2 .5 　稳定性试验
取供测试样品溶液20 μL , 分别于制备后0 , 2 , 5 , 10 , 15 h 注入液相色谱仪, 按照上述优化色谱条件测定,计算峰面积:3-联苯甲酸RSD 为0 .37 %, 4-联苯甲酸RSD 为0 .65 %.结果表明:供测试样品溶液在15 h 内稳定性良好.

2 .6 　回收率试验
称取已知含量的混酸样品3 份, 分别置于50 mL 容量瓶中, 向这3 份溶液中分别精密加入从低到高的3-联苯甲酸和4-联苯甲酸对照品, 按上述优化色谱条件测试两者的峰面积, 计算回收率.结果显示两者在低、中、高3 种质量浓度下的平均回收率分别是:3-联苯甲酸平均回收率为99 .4 %, RSD 0 .87 %;4-联苯甲酸平均回收率为98 .8 %,RSD 0 .93 %.相关数据见表1 .

2 .7 　样品的测定
按照本方法测试条件, 分别测定3 个不同批次样品, 采用外标法计算混酸中3-联苯甲酸和4-联苯甲酸各自含量, 测定结果见表2(n 为平均取样次数).
表1　2 个同分异构体的回收率测定结果

测定项目   本底值加标量/(g·L-1) 测定平均值/(g·L-1) 回收率/ %
  
                        0 .03             0.053(n =6)               97 .6
3-联苯甲酸    0.024            0 .10 0.125(n =6)      101 .2
                        0 .20             0.221(n =6)               99 .5