分光光度测定法专题之5,5-双硫代对硝基苯甲酸检测法

摘要：5,5-双硫代对硝基苯甲酸（DTNB）可以作为显色剂在合适的PH的条件下与被测酶的氧化物反应生成黄色5-硫代-2-硝基苯甲酸阴离子，该阴离子能够在412nm处能够检测处最大吸收峰，测定出该离子的浓度，再通过计算便可得到被测酶的含量。本文介绍了DTNB分光光度法检测血清(浆)GSH-Px活力。
关键词：5′5-双硫代对硝基苯甲酸，DTNB, 69-78-3，检测，分光光度法
 
前言
 
DTNB，5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)，CAS号: 69-78-3，分子式: C14H8N2O8S2，分子量: 396.35，广泛用于生化研究，是生化反应色原，诊断试剂研究生产，测定蛋白质、多肽和组织中巯基的灵敏测定试剂。有机磷农药中毒的监测（胆碱酯酶测定）。本文介绍了DTNB分光光度法测定血清(浆)GSH-Px活力。
 
1      检测原理
 
GSH-Px可催化以下反应
                                CSH-Px
2GSH  +  H2O2  ========= GSSG   +   2H2O2
 
        终比酶促反应，反应体系中剩余的SH与酶活力成反比，它与显色剂DTNB在合适的pH条件下反应生成黄色的5-硫代-2-硝基苯甲酸阴离子，此阴离子在412nm处有最人吸收，测定该阴离子的浓度，便可计算出-SH的减少量。由于-SH在没有酶的条件下也能进行氧化(非酶促反应)，所以最后计算酶活力时必须扣除非酶反应所引起的-SH的减少。
 
2 分光光度法检测血清(浆)GSH-Px活力
 
2.1 血清GSH-Px稳定性
 
        将不同血清标本分别存放于4℃和-4℃,结果表明4℃存放,第三天酶活力降低,-4℃贮存酶活力可稳定1周。
 
2.2 血清GSH-Px操作步骤
 
       分别设置测定管和非酶管，加入1.Ommo1/L GSH0.2m1，血清0. 2m1(非酶管加重蒸水0. 2ml替代血清)，各管再加入0. 1mlH2O2, 0. 8ml三氯醋酸，经离心后取上清液0. 8ml，加入DTNB显色液，另设置空自管，操作同非酶管，但以磷酸盐缓冲液替代(}SH溶液，412nm处，以空自管调零测定各管A bs.用分光光度计进行检测。

结束语
 
Faraj[5]曾比较了几种测定GSH-Px活力的方法,酶偶联法特异性强,灵敏度高,但所需的谷光甘肽还原酶需进口。荧光法较比色法灵敏度高,但需采用荧光分光光度计。本分光光度法具有操作简便,精密度高,试剂易购,不需要特殊仪器等优点,便于临床实验推广应用。
 
参考文献
 
[1]曾勤,陈耿等，DTNB比色法测定血清(浆)GSH-Px活力[J]，1997年12月.