邻氯扁桃酸
背景及概述[1]
邻氯扁桃酸，又名α-羟基邻氯苯乙酸（2-chloromandelicacid），分子式C8H7O3Cl，相对分子质量为186.5，具有R型和S型两种对映体构型，在医药生产、不对称合成、光学拆分等多个领域都有广泛的应用。而其中L-邻氯扁桃酸可以合成新型安全高效的抗血小板聚集药物氯吡格雷（clopidogrel）。氯吡格雷的化学名为(+)-(S)-α-(2-氯苯基)-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-5（4H）-乙酸甲酯，临床上用于预防心肌梗塞、中风或有外周动脉疾病史患者的动脉粥状样硬化，与其它几种应用比较广泛的血小板抑制剂（阿司匹林、噻氯匹定等）相比较，作用强度和耐受性高于噻氯匹定，而与阿司匹林的总体耐受性相似，副作用也较其它几种血小板抑制剂更小。该产品由法国赛诺菲和美国施贵宝于1996年联合开发，1997年获得FDA批准，1998年3月正式在美国上市，商品名为“波立维”，2008年全球销售额为94亿美元，单药销售收入排名全球第二，是目前最畅销的药物。
应用[1]
L-邻氯扁桃酸可以合成新型安全高效的抗血小板聚集药物氯吡格雷：
制备[1-2]
1. 不对称合成法
不对称合成法是不经过拆分直接合成手性产物的一种方法，主要有：手性醇氰酶-化学法、腈水解酶法、不对称还原法、化学合成法等。目前，以手性催化剂不对称合成的方法很少在生产中得到应用，这可能是因为化学催化剂及其合成所需化学试剂价格昂贵，而生物催化剂催化效率仍然不高等问题，而邻氯扁桃酸的空间位阻也是限制其催化效率的主要因素。但近年来对不对称合成法的研究呈上升趋势，许多方法都得到高选择性的产物。
1）手性醇氰酶-化学法
手性醇氰酶（hydroxynitrileslyases，HNL，E.C.4.1.2.10）是一种来源于高等植物、用来抵御外敌的关键酶，能高度选择性地催化合成手性氰醇。手性醇氰酶法从醛或酮出发，加入氰氢酸，合成具有光学活性的α-羟基酸为终产物的方法，可用于合成L-邻氯扁桃酸。
以往氯取代的苯甲醛及其衍生物由于空间位阻的限制而无法提高产量及选择性，近来随着微水相有机相（二异丙醚）、缓慢添加底物方法、固定化技术等的结合，提高了腈产物的立体选择性。
2）腈水解酶法
腈水解酶法是直接催化腈水解、一步生成羧酸及氨的方法，腈水解具有高度化学、区域和立体选择性。目前关于立体选择性腈水解酶的报道很多，但是能作用于芳基乙腈类的不多，已有研究表明，粪产碱菌、恶臭假单胞菌等能够产生立体选择性的腈水解酶，作用于外消旋扁桃腈，水解生成(R)-扁桃酸，并且产物的e.e.值都较高。但是以扁桃腈苯环上邻位取代的衍生物作为底物的研究报道则很少。DeSantis等通过直接提取环境中的DNA，创建了基因文库，对该基因文库进行筛选，得到200多种腈水解酶。将这些腈水解酶用于混旋扁桃腈的水解，发现其中27种具有水解活力，对其中活力最高的腈水解酶Ⅰ进行底物特异性研究，发现可作用于邻氯扁桃腈，得到L-邻氯扁桃酸，e.e.为97%，但是酶活力不高，机理见图。
3）对称还原法
利用手性的还原酶的催化作用，也可以得到单一的对映体。从Leuconostoc mesenteroidessubsp.dextranicum菌株中分离得到α-酮酸还原酶，在NADH辅酶条件下，能生产手性的α-羟基酸。将该还原酶分离纯化后催化还原2-氯苯乙酮酸得到L-邻氯扁桃酸，其产率达100%，e.e.值大于99%。而利用E.coli重组细胞表达这种还原酶，同样成功达到高产率高选择性生产L-邻氯扁桃酸的目的。但合成2-氯苯乙酮酸底物的步骤复杂繁多，辅酶价格昂贵，增加了生产的成本。直接利用面包酵母还原制备L-邻氯扁桃酸及其酯化合物，以2-氯苯甲酰甲烷、2-氯苯甲酰乙烷、2-氯苯甲酰丁烷为底物转化为2-氯扁桃酸烷酯，转化率分别为99.9%、88.5%、99.7%，手性e.e.值分别为98.4%、98.5%、98.4%，进一步水解得到酸产物。酵母还原的方法简便，过程精简，成本低廉，但缺点是步骤繁多。
4）化学合成法
化学合成法是利用化学的方法不对称合成手性产物，较生物法合成效率高稳定性好。用氰化和乙酰化方法从2-氯苯甲醛出发利用手性配体，手性催化法制备(R)-o-乙酰氰醇，然后通过水解(R)-o-乙酰氰醇获得L-邻氯扁桃酸，但这个步骤需要重结晶，并存在许多反应过程中的问题。采用将邻氯苯乙醛立体选择性的制得对应的氰化的腈，再水解得到邻氯扁桃酸。具体方法是2-氯苯乙醛与三乙基硅氰制得(R)-邻氯扁桃腈硅酯，然后水解得到L-邻氯扁桃酸并重结晶纯化，得到大于99%的纯度。而此类化学合成法需要催化剂价格昂贵，反应污染大，回收不便，反应条件要求严格。
2. 光学异构体拆分法
光学异构体拆分是首先建立在合成外消旋的、邻氯扁桃酸、然后再拆分的方法。光学拆分是目前主要用于制备手性邻氯扁桃酸的方法，虽然仍然受到空间位阻的影响，但许多拆分剂都能达到较好的拆分效果，国内目前研究较多，在拆分机理方面也进行了相关的研究。
1）外消旋邻氯扁桃酸合成
目前合成外消旋邻氯扁桃酸的方法主要以下几种。
①相转移催化法。采用四乙基氯化铵（TEAC）和四乙基溴化铵（TEAB）等作为相转移催化剂，产物经乙酸乙提取以及苯或甲苯重结晶后，粗产率可达95%，纯品产率可达54%，产品纯度可达99%，且反应时间缩短为24h。用便宜易得的氯仿来代替溴仿来改进上述方法，大大降低了生产成本，且整个制备过程中不需要取出邻氯扁桃酸的粗品，操作轻松，产品质量高，适合工业应用。
②氰化水解法。通过氰化、水解、除盐和精制4步操作得到邻氯扁桃酸，收率约为70%。与之前不同的是，该法采用的氢氰酸为气体氰化氢或质量分数为20%～80%的氢氰酸水溶液，原料易得，并且提高了收率。
③酶催化法。报道利用RhodococcuserythropolisNCIMB11540全细胞中的腈水合酶和酰胺酶的共同作用，将邻氯扁桃腈水解成邻氯扁桃酸。
④以邻氯苯甲酸或邻氯苯乙酮为原料合成法。以邻氯苯甲酸为原料，在三乙胺的作用下与二倍量的二乙偶磷氰酸酯（DEPC）反应，得到二氰基磷酸盐，然后在酸性条件下水解，得到邻氯扁桃酸，收率为89%。以邻氯苯甲酸或邻氯苯甲醛为起始原料，制备邻氯苯甲酚氯，邻氯苯甲酞氯和丙二酸二乙酯在乙氧基镁的催化下反应，在酸性条件下脱羧得到邻氯苯乙酮，然后对邻氯苯乙酮进行氯化、水解，获得最终产品邻氯扁桃酸，纯品收率为84.7%。
2）外消旋邻氯扁桃酸拆分
A：非对映体盐法拆分，化学拆分外消旋体是一种传统方法，它是用手性试剂将外消旋体混合物中的两个对映体转变成非对映体，然后利用其物理性质差别将非对映体分开（如用重结晶法），最后脱去拆分剂，就可分别得到一种对映异构体。通过形成非对映体盐法来拆分化学合成的外消旋邻氯扁桃酸，从而得到两种对映体。该法十分成熟，易于实现工业化，利用光学活性的α-苯乙胺（PEA）拆分扁桃酸已成熟。
而对于邻氯扁桃酸，N-苄基-α-苯乙胺（BPA）首先被用做拆分剂，在乙酸异丙酯中进行拆分，所得产品的光学纯度可达99%以上，收率大于90%。但BPA价格昂贵，不宜大规模工业化制备，而且该方法需要重结晶。采用光学活性的1-(p-硝基苯基)-2-氨基-1,3-丙二醇（SA）作拆分剂，添加适量的NaOH，以水作溶剂，所得产品光学纯度99%，拆分剂回收方便，其回收率在90%以上。拆分实验的基础上，运用三点作用模型，结合HMR分析，探讨了氢键、空间位阻等在拆分过程中的作用，研究表明拆分剂通过形成非对映体盐法拆分外消旋体的过程中，成盐键力是拆分的基础，非对映体盐间氢键的存在对拆分起关键作用，空间位阻等多点性作用力对拆分结果有一定的影响。也有使用其它拆分试剂，如光学活性丙氨酸来拆分得到手性纯的邻氯扁桃酸。通过(S)-(+)-丙氨酸或(R)-(-)-丙氨酸与外消旋的邻氯扁桃酸混合溶解，然后重结晶，在两相溶液中分离混合物，最后在有机溶剂中提取邻氯扁桃酸，得到高手性纯的产物。
B：酶法拆分：酶法拆分是一种动力学拆分方法，最常用的就是通过降解其中一种对映体，而留下另一种构型，达到拆分的目的。筛选到一株含立体选择性扁桃酸脱氢酶的产碱菌，该菌通过选择性降解邻氯扁桃酸中的S型对映体，进而得到R型邻氯扁桃酸，收率可达46%，e.e.达99.9%，但是若增大底物浓度至50mmol/L，e.e.值则会大大降低。由于该法采用选择性降解其中一种构型得到所需的对映体，因此转化率受到限制，无法超越50%，具有一定的局限性。
C：色谱法拆分：以氨基酸和金属离子作为手性流动相添加剂的配体交换色谱已经被广泛应用于手性物质分离，但是用于拆分手性扁桃酸及其衍生物则较难，因其紫外吸收波长短，而最常用的Cu2+作为配合离子时有很强的紫外吸收。分别考察了3种L-氨基酸（脯氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸）和5种金属离子（Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+和Cd2+）不同组合对邻氯扁桃酸的拆分。结果表明，以Zn2+作配合离子与亮氨酸组合，可以较好地拆分邻氯扁桃酸。而利用手性柱也能达到拆分邻氯扁桃酸的目的，有报道称改变不同的流动相配比，选用Chiralcel等各种高效液相色谱柱柱型，均可较好地拆分邻氯扁桃酸。色谱法具有较好的容量、选择性和稳定性，拆分纯度最高，在手性拆分中发挥越来越重要的作用，但是该法设备费用太高，消耗大，成本太高，处理量小，因此仅限于检测以及实验室制备无法用于商业生产。
D：分子印迹法拆分：目前也有报道采用分子印迹技术来拆分邻氯扁桃酸。采用分子印迹技术合成仿生高分子材料，即分子印迹聚合物（MIP，类似于大孔吸附树脂的高分子吸附材料），应用于手性分子识别的研究，正逐渐受到人们的重视。分子印迹聚合物是由模板分子（待测或待分离分子）、可聚合的功能单体、交联剂和引发剂聚合成固状材料后，洗脱除去模板分子而得，聚合物中模板分留下的孔穴及孔穴上活性基团与模板分子的形状及官能团互补，对难以分离的手性异构体可进行较好地检测和分离。以右旋邻氯扁桃酸为模板，丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯分别为功能单体和交联剂，采用沉淀聚合法制备了分子印迹聚合物微球，省却传统聚合法中粉碎、研磨等步骤，具有比传统分子印迹聚合物更高的结合量和更快的结合速率。并且通过紫外研究了模板与单体之间的作用力，利用Hyperchem模拟了两者形成的配合物的分子结构，在MIP中留下的两种结合位点由Scatchard分析得到证实。由于有特异识别性的结合位点，MIP对右旋邻氯扁桃酸具有较高的识别能力，MIP颗粒有望作为高效液相色谱柱材料用于拆分邻氯扁桃酸外消旋混合物。该小组还以混旋邻氯扁桃酸为模板分子和合成的(S)-(1-萘乙基)-丙烯酰胺为手性功能单体制备MIP作为色谱固定相，对混旋邻氯扁桃酸有较好的拆分能力，分离因子达到1.36，从而打破了必须以纯光学对映异构体为模板的局限性，使分子印迹技术得到进一步应用。
E：毛细管电泳法拆分：毛细管电泳（CE）是一种电迁移技术，因具有高效、快速、经济等特点，广泛应用于各种药物对映体的分离，其原理是加入手性选择剂使与对映体分别结合，根据对映体和选择剂结合的稳定常数的区别进行分离。该方法使用的手性选择剂主要是环糊精β-CD或改性β-CD，其机理是基于环糊精疏水空腔与对映体的包含作用的差异。
参考资料
[1] L-邻氯扁桃酸的制备技术进展
[2] 郑裕国，薛亚平，柳志强，等. 生物催化法生产R-扁桃酸及其衍生物的方法：中国，101701243[P]. 2010-05-05.